BIOTEKNOLOGI

Analisis keragaman genetik dan filogeni molekular bangsa kura-kura air tawar (Reptilia: testudines)
di Indonesia sebagai dasar pelestarian dan pemanfaatannya: laporan akhir RUT V, 2000/2001 (Genetic
diversity analysis and molecular phylogeny of fresh watert Turtles (Reptile: testudines) in
Indonesia as basic conservation and it’s utilization: final report of RUT V, 2000/2001)
Pada saat ini di Indonesia maupun di negara-negara yang sedang berkembang lainnya telah terjadi
penurunan populasi bangsa kura-kura air tawar yang pesat. Namun berbagai informasi biologis
yang diperlukan sebagai dasar manajemen konservasi dan meninjau prospek pemanfaatannya masih
sangat kurang. Telah melakukan dilakukan analisis molekular terhadap struktur populasi dan
berbagai fenomena genetika sebagai jalan pintas sebelum informasi biologis lainnya diungkapkan.
Selama pelaksanaan penelitian telah dikumpulkan sampel DNA murni dari 18 spesies anggota
Testudines yang berasal dari 4 famili, yaitu Trionychidae, Emididae, Chelonidae dan Chelidae.
Beberapa pendekatan analisis keragaman DNA telah dilakukan dan yang memberikan hasil yang
layak untuk digunakan lebih lanjut adalah teknik PCR-RFLP dan PCR-sequencing terhadap penanda
molekular genom mitokondria. Beberapa pasang primer yang didesain sebagai titik kunci penanda
molekular yang berkenaan dengan teknik PCR telah dibuktikan kehomologiannya antar spesies
kura-kura air tawar. Menggunakan marker molekular genom mitokondria (gen CytB, Dloop dan
beberapa tRNA) diketahui bahwa walaupun jumlah populasinya menurun dengan pesat tetapi bangsa
kura-kura air tawar di Indonesia (terutama labi-labi) masih mempunyai tingkat keragaman genetik
yang tinggi. Pusat keragaman labi-labi di Indonesia bisa disebutkan berada di Sumatera (Pengarang)

Kacang tanah transgenik tahan peanut stripe virus (PStV) dan analisis molekuler mekanisme
ketahanannya terhadap virus: laporan akhir RUT VII, 2000/2002 (Transgenic peanut resistant to
peanut stripe virus (PStV)and molecular analysis of its resistance mechanism to virus: final report
of RUT VII, 2000/2002)

Salah satu kendala budi daya kacang tanah adalah serangan peanut stripe virus (PStV). Galur
kacang tanah tahan PStV hasil pemuliaan tanaman tidak dapat dikembangkan karena gen ketahanan
terhadap PStV tidak ditemukan di antara plasma nuftah kacang tanah. Kacang tanah transgenik
tahan PStV hasil rekayasa genetika dapat dijadikan sebagai alternatif untuk keperluan tersebut
sehingga perlu diteliti. Untuk itu perlu dikembangkan metode baku rekayasa genetika kacang tanah
dan disiapkan gen anti virus (yaitu gen CP PStV) yang efektif untuk melindungi kacang tanah transgenik dari infeksi PStV. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan galur kacang tanah
transgenik tahan PStV dan mempelajari mekanisme ketahanan tanaman transgenik terhadap virus
secara molekuler. Untuk mencapai tujuan yang diinginkan, berbagai penelitian telah dilakukan.
Pertama, mempelajari mekanisme ketahanan tanaman transgenik terhadap virus. Bagian penelitian
ini dibagi menjadi tiga kegiatan, yaitu: 1) menghasilkan populasi tanaman transgenik model N.
benthamiana yang masing-masing membawa salah satu dari empat tipe gen CP PStV, 2) mempelajari
tipe gen CP PStV yang efektif untuk melindungi tanaman transgenik model dari infeksi PStV, dan
3) mempelajari mekanisme ketahanan yang didapat pada tanaman model menggunakan analisis
molekuler. Kedua, menghasilkan tanaman kacang tanah transgenik tahan PStV. Bagian penelitian
ini dibagi menjadi empat kegiatan, yaitu: 1) mengembangkan metode introduksi gen (rekayasa
genetika) ke kacang tanah dengan bantuan Agrobacterium, 2) meregenerasikan kacang tanah
transgenik yang membawa gen CP PStV terpilih, 3) menguji ketahanan kacang tanah transgenik
terhadap infeksi PStV, dan 4) mengembangkan galur kacang tanah transgenik tahan PStV. Pada
akhir penelitian, populasi tanaman transgenik yang membawa berbagai tipe gen CP PStV telah
berhasil diregenerasikan dan dievaluasi responsnya terhadap infeksi PStV. Hasil penelitian ini
menunjukkan tanaman N. benthamiana transgenik yang membawa gen CP PStV menjadi resisten
terhadap infeksi PStV. Sifat resisten yang dihasilkan dapat diturunkan secara seksual dari satu
generasi ke generasi selanjutnya, dan bersifat stabil. Selain itu, metode baku transformasi genetik
untuk tanaman kacang tanah telah dihasilkan dan tanaman kacang tanah transgenik yang membawa
gen CP PStV juga telah diproduksi. Pengujian terhadap sebagian tanaman transgenik kacang tanah
yang didapat menunjukan tanaman tersebut juga menjadi resisten terhadap infeksi PStV. Dengan
demikian, tanaman transgenik kacang tanah yang diperoleh dapat digunakan untuk membantu
program pemuliaan tanaman kacang tanah terutama untuk mendapatkan sifat resisten terhadap
infeksi PStV. Hasil penelitian telah dipresentasikan di berbagai seminar ilmiah nasional ataupun
internasional dan akan disiapkan sebagai bagian dari internet web site dengan alamat http://pmbipb.
tripod.com/RUTVII.(Pengarang)

Kloning dan karakterisasi gen pengkode protein penyebab sensitivitas terhadap plumbagin pada
Mycobacterium smegmatis: laporan akhir RUT VII, 1999/2002 (Cloning and characterization of
protein encoded gene causing sensitivities against plumbagin on Mycobacterium smegmatis: final
report of RUT VII, 1999/2002)

Mycobacterium tuberculosis merupakan penyakit intraseluler dan salah satu mekanisme yang diduga
dapat membuat bertahannya mikroba ini di dalam sel adalah mekanisme pertahanan sel terhadap
radikal bebas yang pada umumnya mematikan mikroba lainnya. Penelitian ini bertujuan untuk
menyingkap mekanisme pertahanan sel mycobacterium terhadap radikal bebas superoksida.
Dilakukan identifikasi gen-gen yang terlibat dalam mekanisme pertahanan diri terhadap pembagian,
yaitu senyawa yang di dalam sel dapat mengakibatkan terbentuknya radikal bebas superoksida,
dengan asumsi bahwa sembagian akan berinteraksi atau mengaktivasi enzim-enzim yang terlibat
dalam sistem pembentukan radikal bebas di dalam sel M. smegmatis. Metodologi penelitian dilakukan dengan pendekatan mutagenesis acak menggunakan transposon yang membawa gen
pengkode resistensi terhadap kanamisin mutan yang diperoleh dengan menanamkan M. smegmatis
dalam medium 7H10 yang mengandung kanamisin. Kemudian dilakukan mutagenesis acak,
dilanjutkan dengan seleksi mutan yang super positif, diteruskan dengan konfirmasi fenotip mutan
transposon, sekuensing program klon DNA yang mengandung transposon dan akhirnya dilakukan
analisis hasil sekuensing. Berdasarkan penelitian diperoleh mutan yang berbentuk kasar, perubahan
dinding sel ini mungkin menyebabkan transpor pembagian ke dalam sel menjadi lebih mudah dan
akibatnya jumlah superoksida yang terbentuk di dalam sel menyebabkan kematian sel mycobacterium.
Berdasarkan fenomena tersebut, disimpulkan bahwa perubahan pada permukaan sel Mycobacteria
menyebabkan organisme lebih mudah dimatikan oleh superoksida yang diproduksi dalam
sel makrofoga. Peptida sintase dapat dijadikan target bagi pengembangan anti tuberkulosis baru,
karena inhibisi enzim ini dapat mengakibatkan perubahan komposisi glikopeptidilipid yang
akibatnya sel tidak akan bertahan di dalam sel makrofaga.(RNR)

Model pembakuan protein E rekombinan virus dengue dengan Baculovirus sebagai kandidat vaksin
klon subunit isolat Indonesia: laporan akhir RUT VII, 1999/2001 (Established model of recombinant
E protein of dengue virus with Baculovirus as a candidate clone sub unit vaccine Indonesia
isolate: final report of RUT VII, 1999/2001)

Telah dilakukan penelitian untuk mendapatkan model pembakuan protein E rekombinan virus
dengue dengan Baculovirus sebagai kandidat vaksin klon sub unit isolat Indonesia. Virus dengue
hasil isolat TDC dan NAMRU-2 Jakarta, telah dipurifikasi, diidentifikasi dengan semi nestedpolymerase
chain reaction (nested-PCR). Selanjutnya virus diproduksi dengan menginokulasikan
pada sel kultur C6/36 dan sel vero, sehingga didapat partikel virus yang cukup banyak sebagai
bahan identifikasi gen dan kloning protein E. Gen protein E di identifikasi homologinya dengan
cara sequensing. Selain itu juga diketahui bahwa virus yang dipasasekan pada sel kultur berkalikali
dapat menyebabkan beberapa mutasi pada nukleotidnya, tetapi tidak merubah sifat imunogennya
sesuai dengan hasil karakterisasi protein E, dan pada tahap pemfusian dilakukan pemotongan dengan
enzim restriksi yaitu Hae III, Hinf I, RSA I dan Alu I. Plamid yang digunakan untuk pengekspresian
protein E dengan Baculovirus adalah pVL-941-poly yang disisipkan dengan D1234EH6 dan
selanjutnya ditransfer ke AcRP23-LacZ. Hasil dari pengekspresian setelah dianalisis dengan immunofluorescence
dan immunoblotting menunjukkan bahwa, protein E diekpresikan selain pada
cairan supernatan sel kultur juga ditemukan secara intraseluler. Hal ini kemungkinan gen protein E
yang didominasi oleh galur virus yang tidak menginduksi timbulnya cytopathogenic effect (CPE).
Protein E hasil rekombinan setelah dilakukan isolasi dan purifikasi mempunyai sifat reaktifitas
yang tinggi, terbukti dari uji immunoblotting menunjukkan adanya reaksi yang kuat dan spesifik
protein E rekombinan. Profil antibodi pada hewan coba yang diimunisasi dengan protein E
rekombinan menunjukkan adanya titer antibodi yang tinggi dan protektif serta dapat menginduksi
beberapa macam imunoglobulin dan subklase (IgM, IgG, IgG1, IgG1a, IgG2a, IgG2b). Hal ini
sesuai dengan hasil uji tantang. Pada hewan coba mencit, tikus dan kelinci profil titer antibodinya hampir sama, begitu juga pada kontrolnya tidak menunjukkan adanya gejala yang patognomonis
terhadap infeksi dengue haermorrhagic fever (DHF), tetapi viremia ditemukan pada semua
kelompok kontrol. Pada kelompok hewan coba monyet terdeteksi titer antibodi netralisasi yang
ditimbulkan tinggi. Hasil ini dapat ditunjukkan pada uji tantang. Pada kelompok kontrol selain
terjadi viremia juga menunjukkan gejala patognomonis yang mirip dengan DHF yaitu terjadi
haemorragie pada kulit yang tidak berbulu dengan temperatur yang tinggi dan disertai diare. Jadi
profil antibodi secara keseluruhan pada hewan coba yang diimunisasi dengan protein E rekombinan
menunjukkan adanya respons imun baik humoral maupun seluler dengan penekanan pada respons
imun humoral. Sehingga protein E rekombinan dengan Baculovirus dapat digunakan sebagai bahan
vaksin klon subunit yang ideal dan aman. (Pengarang)

Pemetaan genom pengendali produktivitas minyak pada kelapa sawit: laporan akhir RUT VII,
1998/2000 (Genome mapping controlling the oil palm yield traits of palm oil : final report of RUT
VII, 1998/2000)

Upaya peningkatan produktivitas minyak dengan pendekatan genetika dan pemuliaan tanaman
selalu menghadapi kendala klasik, seperti: 1) siklus pemuliaan yang panjang; 2) informasi genetik
pada populasi dasar yang langka; dan 3) sifat biologi tanaman yang kompleks dan penyerbuk
bebas (outbred). Oleh karenanya, diperlukan langkah-langkah untuk mempercepat siklus pemuliaan
dan meningkatkan ketersediaan informasi genetik sehingga perolehan genotipe kelapa sawit unggul
dengan produktivitas minyak yang tinggi dapat dipercepat. Penggabungan marka DNA ke dalam
program seleksi marker-assisted selection (MAS) diketahui mampu meningkatkan efektivitas
seleksi. Ketersediaan peta pautan genetik dan peta lokus-lokus sifat kuantitatif quantitative trait
loci (QTL), seperti QTL yang berasosiasi dengan komponen produktivitas minyak, merupakan
prasyarat untuk menerapkan MAS. Penelitian ini dilaksanakan dengan tujuan: 1) membentuk peta
pautan genetik pada kelapa sawit, 2) mendeteksi lokasi lokus-lokus (QTL) yang berasosiasi dengan
komponen produktivitas minyak pada kelapa sawit, dan 3) menduga pengaruh genetik QTL yang
berasosiasi dengan sifat-sifat penentu produktifitas minyak. Dengan menggunakan marka molekuler
(DNA) dan strategi pseudo-test cross maka lokus-lokus sifat kuantitatif (QTL) yang berasosiasi
dengan produktivitas minyak akan terdeteksi. Lokus DNA yang berasosiasi dengan komponen
produktivitas minyak dan mempunyai pengaruh genetik yang besar akan bermanfaat untuk
meningkatkan efektifitas program seleksi. Hingga akhir tahun ke-3, penelitian ini telah mencapai
beberapa sasaran penting, antara lain: 1) ketersediaan data kuantitatif untuk analisis QTL, 2)
terlaksananya penapisan 207 primer, dan 3) terbentuknya peta pautan pada dura elite (PA 131 D
self) dan tenera elite (RS 3 T self). Beberapa lokus yang menunjukkan indikasi terpaut dengan
lokus Sh, yaitu lokus OPO-06_1 dan OPD-03_3 juga telah berhasil diidentifikasi. Hasil penyusunan
peta pautan genetika dan identifikasi marka yang berasosiasi dengan QTL dapat diaplikasikan
untuk membantu seleksi pada industri perbenihan sebagai upaya untuk meningkatkan efektivitas
pemuliaan. (Pengarang)

Pendekatan bioteknologi untuk meningkatkan kadar sistein dan metionin biji kedelai varietas tahan
kering produksi tinggi: laporan akhir RUT VII, 2002 (Biotechnology approach to increase cysteine
and methionin contents on high producing and drought tolerance variety of soybean: final
report of RUT VII, 2002)

Biji kedelai memiliki kandungan protein yang cukup tinggi dan merupakan sumber utama protein
nabati tinggi bagi manusia dan hewan. Tetapi di samping produksinya rendah karena terbatasnya
varietas komoditas ini yang mampu beradaptasi dengan kondisi kering pada lahan marginal, nilai
protein yang dikandungnya adalah sekitar 55%, nilai biologis protein hewani baik untuk keperluan
manusia maupun untuk pakan ternak. Hal ini karena kualitas dari suatu protein sangat ditentukan
oleh proporsi asam amino belerang, maka dengan rendahnya kadar sistein (1,4 g/16 g N) dan
metionin (1,1 g/16 g N) protein efficiency rasio (PER) biji kedelai menurun sekitar 1,3. Pendekatan
bioteknologi merupakan alternatif yang menjanjikan, sebagaimana yang telah berhasil dilakukan
pada beberapa tanaman, untuk meningkatkan kandungan protein kaya asam amino sistein dan
metionin biji kedelai, karena usaha dan penelitian selama ini dengan manipulasi faktor lingkungan
tumbuh dan pemuliaan tanaman konvensional belum menunjukkan adanya kemajuan yang berarti.
Penelitian ini bertujuan menghasilkan tanaman kedelai transgenik yang mengekpresikan gen albumin
bersifat tahan kering dan produksi tinggi. Penelitian diawali dengan seleksi varietas kedelai
lahan kering yang berasal dari berbagai wilayah sentra produksi kedelai di Nusa Tenggara Barat.
Biji hasil koleksi diuji kandungan proteinnya dan dilakukan seleksi di rumah kaca dengan perlakuan:
20%, 40%, dan 00% air tersedia. Hasil seleksi menunjukkan bahwa varietas mata kucing, gora
dompa, kepet dan wilis dapat bertahan memproduksi biji dan biomassa yang relatif tinggi dibanding
yang lainnya pada kondisi 40% air tersedia. Studi awal regenerasi kedelai in vitro menunjukkan
media MS tanpa PGR cocok untuk induksi akar dan tunas pada eksplan biji muda yang diisolasi
dari polong; media MS yang mengandung NAA dapat digunakan untuk induksi akar dan tunas
eksplan batang+kotiledon, sedangkan kalus embriogenik dapat diinduksi pada media MS+2,4-
D+NAA dan media MTOK 1/2 MS untuk menginduksi akar dan batang. Isolasi gen albumin dari
bunga matahari lokal (serngenge) dengan bantuan PCR dengan primer spesifik yang didesain dari
full length sequence SFA8. Fragmen hasil amplikasi (600 bP) di klon pada situs BamHI pUCI8.
Hasil sekuensing DNA insert dengan metode dye primer cycling sequence menunjukkan homologi
sekitar 90% dengan gen SFA8 yang telah diisolasi oleh Kurtt et al. dari bunga matahari. Fragmen
tersebut disisipkan pada palsmid biner pBII21 pada situs unik BamHI. Plasmid biner ini ditransfer
ke E. coli dan selanjutnya ditransfer ke A. tumefaciens dengan triparental mating dengan pRK2013
sebagai helper. Seleksi dengan media mengandung kanamisin berhasil mendapatkan transforman
A. tumefaciens yang membawa pBHII21. Tiga metode diterapkan dalam proses transfer gen albumin
yang telah diklon pada pBHII21 yaitu inokulasi kalus (in vitro), injeksi kecambah in vitro dan
in planta efisiensi transformasi berdasarkan uji ekspresi gen reporter GUS adalah berturut-turut 2-
4% (inokulasi kalus), 8-12% (injeksi) dan 10% positif GUS dan sekitar 30% kimera (in planta).
Analisis PCR menunjukkan gen albumin terdeteksi pada daun dan biji. Hasil analisis ekspresi gen
GUS dan PCR tersebut didukung oleh hasil uji lainnya yaitu seleksi terhadap biji RO pada media yang mengandung 100 ppm kanamisin terhadap semua biji regeneran, dimana 50% dapat tumbuh
(wilis), 100% (gora dompa), 65% (kepet), 90% (mata kucing). Kadar protein biji RO meningkat
sebesar 17,95% (mata kucing) sampai 25,78% (gora dompa). Kadar asam amino sistein biji RO
meningkat sekitar 24% (wilis) sampai 29,23% (gora dompa), dan kadar asam amino metionin
meningkat sebesar 20,6% (wilis) sampai 30% (gora dompa). Uji Northern dan Western perlu
dilakukan untuk konfirmasi lebih lanjut di masa yang akan datang. Dengan demikian, secara
keseluruhan penelitian ini telah menghasilkan tanaman kedelai transgenik-albumin dengan sifat
tahan kering produksi tinggi.(Pengarang)

Perakitan tanaman transgenik kopi arabika tahan terhadap penyakit karat daun: laporan akhir RUT
VII, 1999/2001 (Engineering of transgenic plant of arabica coffee for resistance to leaf rust disease:
final report of RUT VII, 1999/2001)

Pengembangan kopi di Indonesia untuk masa yang akan datang diarahkan untuk perluasan areal
kopi arabika. Akan tetapi kopi arabika cenderung peka terhadap penyakit karat daun oleh jamur
Hemileia vastatrix, yang dapat menurunkan produksi hingga 50% di Indonesia, 70% di India dan
30% di Brazil (Mathew, 1978). Sedangkan penyakit penting yang disebabkan oleh patogen pada
tanaman kopi robusta adalah Rhizoctonia solani, Fomes lamoensis serta nematoda Pratylenchus
coffeae yang menyerang perakaran. Penelitian ini bertujuan melakukan rekayasa genetika tanaman
kopi arabika dengan gen kitinase asal tanaman padi untuk meningkatkan ketahanannya terhadap
penyakit karat daun melalui peningkatan ekspresi gen tersebut serta tetap menjaga produksi dan
kualitas yang tinggi. Kitinase telah dikenal memiliki peranan antijamur dalam mekanisme ketahanan
tanaman terhadap penyakit oleh jamur patogen. Salah satu tahapan penting dalam rekayasa genetika
tanaman adalah ditemukannya metode regenerasi secara in vitro dari sel-sel yang tertransformasi
menjadi tanaman. Prosedur regenerasi untuk kopi robusta telah ditemukan di laboratorium kami,
namun untuk regenerasi kopi arabika masih relatif sulit. Oleh karena itu dalam penelitian ini juga
dilakukan optimasi kondisi kultur untuk regenerasi eksplan kopi arabika. Metode riset dilakukan
dengan introduksi gen penyandi kitinase (chi) ke dalam suatu jaringan tanaman yang dilakukan
melalui bantuan Agrobactorium tumefaciens. Sebelum diintroduksikan ke dalam tanaman, gen
tersebut di klon dalam bakteri E.coli, kemudian dipindahkan ke dalam sel A. tumefaciens dan
selanjutnya bakteri ini akan memasukkannya ke dalam genom tanaman. Mengingat bahwa pada
tanaman kopi sistem transformasi dan regenerasinya relatif sulit, maka sebelum ditransformasikan
ke tanaman kopi arabika, gen anti cendawan terlebih dahulu diuji pada tanaman. Penelitian ini
terdiri atas beberapa tahapan kegiatan, yaitu: 1) konstruksi bakteri E.coli dan A. tumefaciens yang
membawa gen kitinase, 2) evaluasi ketahanan kopi arabika terhadap penyakit karat daun, 3)
pengembangan tembakau dan kopi transgenik yang membawa gen kitinase, 4) deteksi ekspresi
gen kitinase pada plantlet atau tanaman tembakau atau kopi transgenik secara DotBlot dan Western
blotting, 5) deteksi aktivitas kitinase menggunakan sistem gel substrat SDS-PAGE, 6) Bioasai
tembakau transgenik terhadap P. nicotianae, dan 7) pengaruh elisitor etilen terhadap peningkatan ekspresi gen kitinase pada tembakau dan kopi arabika transgenik dan kontrol. Berdasarkan hasil
percobaan, disimpulkan bahwa: 1) rekombinan E. coli yang ditransformasi dengan konstruksi yang
membawa EPE, memiliki resistensi kanamisin lebih tinggi daripada yang tidak membawa EPE, 2)
gen kitinase terekspresi baik pada rekombinan bakteri E.coli maupun A. tumefaciens, 3) aktifitas
enzimatis kitinase pada tembakau transgenik 5-8 kali lebih tinggi daripada non-transgenik, 4) setelah
induksi aktivitas kitinase pada plantlet kopi arabika transgenik sebesar 105,7 m/ml atau 5,7 kali
dibanding kopi arabika normal sebesar 18,5 m/ml.(Pengarang)

Rekayasa genetika tanaman cabai tahan PVY dan strategi pengembangannya melalui pembentukan
cabai hibrida transgenik : laporan akhir RUT IV, 1996/1998 (Genetic engineering of Pepper capsicum
annuum L. resist againt PVY and development strategy thoungh development of transgenic
hybrid pepper : final report RUT IV, 1996/1998)

Cabai (Capsicum annum L.) adalah hortikultura penting di Indonesia, pertanaman cabai mencakup
21 % total luas tanaman sayuran, dengan kenaikan permintaan sebesar 13 % pertahun. Salah satu
kendala budidaya cabai adalah adanya penyakit keriting daun akibat virus, salah satunya potato
virus Y. Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan cabai transgenik yang membawa gen anti
PVY, (gen PVYCP), menyeleksi ketahanan cabai transgenik yang didapat terhadap serangan PVY,
dan menyeleksi cabai non transgenik sebagai tetua untuk pembentukan galur hibrida. Langkah
penelitian meliputi regenerasi tunas cabai secara in-vitro, menghasilkan galur cabai transgenik
yang memiliki tetua non-transgenik tahan PVY.(Pengarang)

Studi biologi molekul DNA-mitokondria dan plasmid-mitokondria jamur Fusarium oxysporum
f.sp. cubense: laporan akhir RUT VII, 2000 (Molecular biology of mitochondrial-DNA and mitochondrial-
plasmid of the fungus Fusarium oxysporum f.sp. cubense: final report of RUT VII, 2000)

Serangkaian penelitian telah dilaksanakan untuk mengetahui karakter genom mitokondria dan
keberadaan plasmid mitokondria serta kaitannya dengan patogenisitas jamur Fusarium oxysporum
f.sp. cubense telah dilaksanakan di Laboratorium Fitopatologi Fakultas Pertanian Universitas
Brawijaya dan Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Gajah Mada. Pengetahuan yang
diperoleh diharapkan dapat digunakan untuk mempelajari secara mendalam mekanisme infeksi F.
oxysporum f.sp. cubense pada tanaman pisang. Mekanisme ini perlu diketahui terutama dalam
usaha menghasilkan tanaman tahan, mengetahui kisaran inang jamur tersebut, menghasilkan
organisme antagonis yang dapat diunggulkan bahkan kemungkinan penggunaan plasmid mitokondria tersebut sebagai vektor dalam proses transformasi pada jamur. Untuk mencapai tujuan
tersebut maka pada penelitian ini dilakukan isolasi dan karakterisasi mtDNA F. oxysporum f.sp.
cubense baik yang patogenik maupun yang nonpatogenik, mtDNA menggunakan enzyme EcoRI,
HindIII, BamHI, PstI, XhoI, BglII, HaeIII, Apa, SacI, SalI dan SmaI, amplifikasi gen rRNA pada
mtDNA menggunakan primer yang terdiri dari basa-basa yang terkonservasi dalam gen rRNA (5'-
GAGTCGACATCGAGGT-3', terkonservasi pada ujung 3' dan 5'-GCAGTGAGGAATATTGG-3',
yang terkonservasi pada ujung 5'). Untuk mengetahui keberadaan dan kaitan plasmid mitokondria
dengan patogenisitas jamur maka dilakukan isolasi serta karakterisasi plasmid mitokondria dari
galur patogenik dan nonpatogenik serta uji homologi antara plasmid mitokondria dengan mtDNA
dan DNA kromosom. Pada penelitian ini berhasil diisolasi tiga fragmen DNA yang berbeda dari 11
isolat F. oxysporum f.sp. cubense yang dianalisa, yaitu sebesar 46-47 kb yang terdapat pada semua
isolat yang dianalisa yang selanjutnya diduga sebagai mtDNA, serta dua fragmen yang lain sebesar
2-3 kb dan 7-8 kb yang hanya terdapat pada tiga dari 11 isolat yang dianalisa yang diduga adalah
plasmid mitokondria. Pada Southern-hibridisasi, kedua fragmen terakhir tidak homolog dengan
mtDNA maupun DNA kromosom. Peta restriksi tidak berbeda di antara 11 isolat F. oxysporum
f.sp. cubense yang dianalisa. Amplifikasi gen rRNA pada mtDNA menghasilkan fragmen DNA ± 1
kb, dan telah disekuen.(Pengarang)

Transformasi genetik padi (oryza sativa)dengan menggunakan Agrobacterium dan studi mekanisme
kontrol dari ekspresi gen menggunakan promotor terinduksi (inducible promoter): laporan akhir
RUT IV, 1996/1998 (Genetic transformation of rice (oryza sativa)using Agrobacterium and control
mechanism study of gene expression using inducible promoter : final of report RUT IV, 1996/
1998)

Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan teknik transformasi tanaman untuk kultivar-kultivar
padi Indonesia menggunakan bakteri Agrobacterium tumefaciens dan melakukan studi mekanisme
kontrol dari ekspresi gen menggunakan promoter terinduksi. Padi yang digunakan dalam penelitian
ini adalah kultivar cisadane, IR 64, dan raja lele. Cisadane merupakan hasil persilangan lokal, IR
64 adalah hasil persilangan International Rice Research Institute, dan rajalele adalah kultivar padi
javanica komersial bernilai ekonomi tinggi. Metode penelitian transformasi menggunakan protokol
Hiei et-al (1994), dengan modifikasi pada media ko-kultivasi, media pengkalusan dan media
regenerasi. Gen yang digunakan pada tahap awal ialah gen penanda gus-A (B-glucuronidase) dan
gen hpt penyandi higromisin phosphotransferase. Dilanjutkan dengan ko-kultivasi menggunakan
protokol hasil modifikasi dan berbagai galur, kemudian dilakukan transformasi tanaman padi dengan
penanda gus-A yang dikontrol oleh promoter terinduksi tetrasiklin dan uji ekspresinya. Terakhir
dilakukan uji kompetensi kultivar cisadane dan rajalele untuk menerima gen ketahanan terhadap
hama dan analisisnya. Berdasarkan hasil penelitian tersebut disimpulkan bahwa: 1) tanaman padi
Indonesia dari kelompok indica dan javanica berhasil ditransformasikan menggunakan teknik
Agrobacterium tumefaciens; 2) tidak diperlukan vektor super binari untuk transformasi; 3) vektor binari yang cocok untuk penyisipan gen lebih lanjut berhasil digunakan untuk induksi gen asing
pada kedua kelompok padi; 4) promoter terinduksi tetrasiklin menggunakan ubiquitin yang difusikan
dengan gen penanda gus-A tidak berhasil menekan ekspresi tersebut; 5) gen penyandi ketahanan
terhadap penggerek batang dan wereng berhasil diintroduksi pada Rajalele dengan ko-transformasi
dengan penebakan DNA. Disarankan untuk mendapatkan hasil yang lebih meluas pada petani,
maka gen ketahanan perlu diintroduksi ke kelompok indica. (RNR)